TEST MOLECOLARI E NODULI TIROIDEI INDETERMINATI (TIR3)

INTRODUZIONE
E’ noto che l’agoaspirato non è sempre in grado di determinare con certezza la natura di un nodulo tiroideo. Nel caso di nodulo indeterminato (o TIR3) è spesso necessario l’intervento chirurgico per avere la certezza circa la benignità del nodulo. Dato che solo il 20% dei noduli TIR3 risulterà essere un tumore, ne consegue che circa l’80% dei pazienti si sarà sottoposto ad un intervento “inutilmente” per un nodulo benigno.
Al fine di ridurre il numero di interventi chirurgici “non necessari” sono state proposte diverse metodiche per stratificare il rischio di malignità dei noduli TIR3 (ecografia, elastosonografia, immunoistochimica, genetica molecolare). Allo stato attuale, i test di genetica molecolare rappresentano indubbiamente le metodiche più avanzate e soprattutto le più incisive e promettenti in quest’ambito.
I test molecolari, pertanto, devono essere considerati come utili strumenti per stratificare il rischio dei noduli tiroidei citologicamente indeterminati (TIR3).

TEST MOLECOLARI DISPONIBILI
Al momento della pubblicazione di questo articolo, sono disponibili in commercio solo i seguenti 4 test:
1)  Afirma (Veracyte, Inc, South San Francisco, California)
2)  ThyroSeq v3 (CBLPath, Inc, Rye Brook, New York, e University of Pittsburgh Medical Center, Pittsburgh, Pennsylvania)
3)  ThyGenX/ThyraMIR (Interpace Diagnostics, Inc, Parsippany, New Jersey)
4)  Rosetta GX Reveal (Rosetta Genomics, Inc, Philadelphia, Pennsylvania)
Il primo test rilasciato sul mercato è stato Afirma (Afirma-GEC) (Alexander 2012), seguito da ThyGenX/ThyraMIR (Labourier 2015), ThyroSeq v2 (Nikiforov 2014) e RosettaGX Reveal (Lithwick-Yanai 2017).
Afirma non è più attualmente disponibile in Europa. Infine, si ricorda, che al momento, il test commerciale attuamente disponibile in Italia ad uso clinico è Thyroseq V3, eseguibile presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma, centro di riferimento in Italia per la genetica molecolare tiroidea.
Nel complesso tutti questi test migliorano la diagnosi preoperatoria dei noduli tiroidei TIR3, potenzialmente evitando migliaia di interventi chirurgici non necessari e in alcuni casi anche suggerendo l’approccio chirurgico più opportuno.

TEST MOLECOLARI – PREMESSE
I test molecolari sopraelencati presentano caratteristiche diverse. Tuttavia, nel confrontare queste metodiche è bene considerare che: a) ciascun test molecolare definisce un risultato in modo specifico e diverso dagli altri (limitandone quindi la possibilità di confronto); b) la risposta di questi test solitamente consiste in solo 2 categorie (benigno o maligno) ma le neoplasie tiroidee, invece, rappresentano un ampio continuum di comportamento biologico piuttosto che un parametro dicotomico (per l’appunto benigno o maligno).
In generale si può affermare che nell’ambito dei noduli tiroidei citologicamente indeterminati (TIR3 A o B), quando il test molecolare ha come scopo principale quello di individuare i noduli benigni, esso richiederà un NPV (valore predittivo negativo) alto, mentre per individuare i noduli tumorali, avrà bisogno di avere un elevato PPV (valore predittivo positivo).

TEST MOLECOLARI – LETTERATURA
In letteratura sono oramai presenti diversi studi scientifici su queste tecniche di genetiche. Molte di questi sono stati anche oggetto di revisione sistematica da parte di un’importante metanalisi in cui sono stati selezionati ed inclusi 26 studi: 19 studi per Afirma-GEC, 5 studi per ThyroSeq v2, 1 studio per ThyGenX/ThyraMIR e 1 studio per RosettaGX Reveal. Per Afirma-GEC, uno studio è stato eseguito in ambito clinico fase di validazione (Alexander et al. 2012) e 18 in studi di post-validazione. Di quest’ultimi, solo uno è stato condotto al di fuori degli Stati Uniti, 5 erano multicentrici e 13 erano single-center. Per ThyroSeq v2, vi sono due studi eseguiti in una fase di validazione clinica (Nikiforov et al. 2014, 2015) e tre sono report di post-validazione (Shrestha et al., 2016, Toraldo et al., 2016, Valderrabano et al. 2017). Tutti gli studi sono stati eseguiti negli Stati Uniti, e sono tutti monocentrici. Ora è disponibile anche l’ultima verisone (Thyroseq v3). Per ThyGenX/ThyraMIR e per RosettaGX Reveal, invece, esistono solo i singoli studi di validazione (Labourier et al., 2015, Lithwick- Yanai et al. 2017).

AFIRMA
Il primo test molecolare Afirma è stato Afirma Gene Expression Classifier (GEC), seguito poi da Afirma-GSC (Genomic Sequencing Classifier) e più recentemente da Afirma-GSC Xpression Atlas.

Afirma-GEC
Afirma Gene Expression Classifier (GEC) è un test basato sul microarray che utilizza un algoritmo proprietario per stratificare il rischio di malignità dei noduli citologicamente indeterminati in base ai profili di espressione dell’mRNA (RNA messaggero) distinguendoli in noduli benigni (GEC-B) o sospetti (GEC-S).Sulla base dello studio principale, Afirma ha alta sensibilità (90%) e modesta specificità (circa 50%) per malignità, corrispondente ad un rischio di malignità del 5-​​6% per i noduli GEC-B e del 37-38% per i noduli GEC-S. Afirma in virtù dell’elevata sensibilità e dell’elevato NPV, è molto efficace nell’individuare i noduli sicuramente benigni e nell’escludere la malignità in caso di citologia indeterminata (nodulo TIR3), rappresentando un ottimo test di esclusione (rule-out).
Il tessuto prelevato dal nodulo TIR3 viene analizzato da alcune cassette di espressione genica preparate per i profili di mRNA associati a carcinoma midollare tiroideo (MCT), tessuto paratiroideo e tumori metastatici. Se positivo, il campione verrà refertato come sospetto (GEC-S). Invece, i campioni che non attivano queste cassette di screening verranno anche analizzati dal principale classificatore di 142 geni.
Lo studio di Alexander del 2012 rimane il punto di riferimento per valutare le prestazioni di Afirma. Tuttavia, dopo questo, sono stati numerosissime le pubblicazioni sull’impiego di Afirma in contesti clinici reali. Ovviamente l’interpretazione degli studi di post-validazione va sempre eseguita con cautela sia perché si tratta, talvolta, di studi retrospettivi sia perché non sempre eseguiti in cieco. In ogni modo, attualmente, Afirma rappresenta indubbiamente una metodica dotata di molta letteratura scientifica. Di tutti gli studi, 12 hanno mostrato un’elevata evidenza di qualità, 6 una qualità moderata e solo 1 una scarsa qualità. Con queste premesse, tutti gli studi, nel complesso, definiscono Afirma come un test altamente efficace nell’identificazione di un sottogruppo di noduli indeterminati TIR3 sicuramente benigni che in virtù del bassissimo rischio di malignità, potrebbero essere seguiti solo clinicamente ed ecograficamente senza un intervento chirurgico (prenota un’ecografia tiroidea con uno specialista endocrinologo). Ed in considerazione dell’elevato numero di studi post-validazione l’efficacia di Afirma ha un’evidenza scientifica elevata.

Afirma-GSC e Afirma-GSC-Xpression Atlas
Quanto appena detto, ed tutti i dati della letteratura scientifica, sono riferiti alla metodica Afirma-GEC. Ma come già accennato all’inizio di questo articolo, la metodica Afirma-GEC è stata nel tempo implementata, con Afirma-GSC e successivamente con Afirma-GSC-Xpression Atlas, con notevole miglioramento delle sue performance diagnostiche nella stratificazione del rischio del nodulo indeterminato. Ovviamente su queste nuove implementazioni non vi sono ancora molti dati disponibili in letteratura proprio perché di recentissima introduzione, ma i dati preliminari evidenziano un miglioramento delle performance della metodica tradizionale. Afirma-GSC è il classificatore di Afirma di nuova generazione presentato nel 2017. Afirma-GSC combina insieme il sequenziamento dell’RNA ed avanzati metodi di studio di estese quantità di contenuto genomico consentendo ad un 30% in più (rispetto ad Afirma GEC) di pazienti di essere identificati come portatori di un nodulo benigno (figura). Uno studio clinico prospettico, multicentrico, in cieco pubblicato su JAMA Surgery ha dimostrato che Afirma-GSC ha mantenuto l’alta sensibilità (91%) di Afirma-GEC e aumentandone la specificità (dal 52% al 68%), con un incremento del 30% dei noduli classificati come benigni (figura), con notevole miglioramento della performance di Afirma-GSC nei noduli benigni a cellule di Hürthle (incremento della specificità al 59%) (figura). Il NVP di Afirma-GSC si conferma superiore al 96% (figura).
Afirma-GSC ha sostanzialmente sostituito il precedente Afirma-GEC nella stratificazione del rischio dei noduli TIR3 ed è stato ulteriormente arricchito con Afirma CSG Xpression Atlas (figura). Afirma CSG Xpression Atlas, infatti, rileva 761 varianti e 130 coppie di fusione da più di 500 geni ed entra in gioco solo in caso di esito di Afirma – Sospetto (figura). Queste alterazioni sono classificate in base ai livelli di validazione clinica riportata dalla letteratura scientifica, fornendo un ulteriore importante strumento nella stratificazione del rischio dei pazienti con nodulo indeterminato TIR3. Il pannello di Xpression Atlas, estrapolato da un’ampia revisione della letteratura, include varianti geniche il cui coinvolgimento nel tumore tiroideo è già ben noto e dimostrato ed altre, meno note, il cui significato clinico è di più recente acquisizione. Ma non bisogna far confusione: Xpression Atlas non è un test di esclusione. Infatti, il rischio di malignità in Afirma GSC Sospetto è simile sia per la variante positiva che negativa, ma può essere uno strumento molto utile nel decision making. Infatti, poiché tali alterazioni sono classificate in base ai livelli di validazione clinica riportata dalla letteratura, in Xpression Atlas potranno essere indicate alterazioni:
–       associate a noduli maligni ma con insufficiente evidenza scientifica;
–    associate sia a noduli benigni che maligni: BRAF K601E, NRAS Q61R, PAX8/PPAR, HRAS Q61R, NRAS Q61K, con un rischio di malignità (ROM) <95%;
–       altamente associate a noduli maligni: BRAF V600E RET/PTC1, RET/PTC3 con un rischio di malignità (ROM) >95%. (figura).
Questo, come si può immaginare, è molto importante perché nei noduli GSC-Sospetti, il riscontro di alcune mutazioni come ad esempio BRAF V600E o RET/PTC, conferiscono la certezza pressochè assoluta (100%) della presenza di un tumore tiroideo, con la conseguente ovvia scelta (chirurgia).
Tuttavia, Afirma non è più attualmente disponibile in Europa.
Infine, si ricorda, che al momento, il test commerciale attuamente disponibile in Italia ad uso clinico è Thyroseq V3, eseguibile presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma, centro di riferimento in Italia per la genetica molecolare tiroidea.

THYROSEQ V2
ThyroSeq v2 è un test multigene basato su sequenziamento mirato di DNA e RNA di ultima generazione con analisi di 56 geni (per esattezza: mutazioni puntiformi e piccole inserzioni/delezioni in 14 geni e 42 fusioni geniche) e livelli di espressione di 16 geni (figura). La convalida clinica di ThyroSeq v2 è stata effettuata in 2 studi monocentrici su noduli tiroidei indeterminati che hanno evidenziato un valore NPV del 96-97% ed un PPV del 77-83% (Figura). Il PPV generale del test può essere ulteriormente perfezionato in ogni singolo campione in base al tipo di alterazione genetica rilevata. Infatti, alcune mutazioni, come BRAF V600E e RET/PTC, conferiscono una quasi certezza di probabilità di cancro, mentre altre mutazioni, come RAS, indicano una probabilità di cancro del’80%. Infine, altre mutazioni, come PTEN e EIF1AX, sono un marker di neoplasia clonale ma da soli non sono sufficienti per lo sviluppo completo del cancro. L’efficacia della metodica ThyroSeq v2 ha un’elevata evidenza scientifica, confermata anche da studi sull’ultima versione Thyroseq v3.
La metodica è attualmente disponibile in Italia.

TEST BASATI SU miRNA
I microRNA (miRNA) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l’espressione genica influenzando la stabilità e la traduzione dell’mRNA. Rispetto all’mRNA, i miRNA sono relativamente più stabili e possono essere isolati dai normali preparati in formaldeide routinariamente ottenuti con il comune agoaspirato. Questo particolare, rende il miRNA un analita molto pratico per la diagnostica molecolare in quanto non è necessario ripetere l’agoaspirato ma è possibile utilizzare i vetrini ottenuti dal precedente agoaspirato.
I due test attualmente disponibili sono: ThyGenX/ThyraMIR e RosettaGX Reveal

ThyGenX/ThyraMIR
ThyGenX è un test di sequenziamento di ultima generazione che misura 10 miRNA, mirato all’analisi di un piccolo numero di mutazioni in 5 geni (BRAF, KRAS, HRAS, NRAS e PIK3CA) e di 3 fusioni geniche (RET-PTC1, RET-PTC3 e PAX8-PPARG) associate a neoplasia tiroidea. Ovviamente i noduli che esprimono la mutazione BRAF V600E o fusioni geniche clonali di RET-PTC1/3 hanno un rischio prossimo al 100% di carcinoma papillare tiroideo (PTC) e questo può giustificare l’intervento di tiroidectomia totale. A parte le mutazioni BRAF V600E e le fusioni di RET-PTC1/3, il resto delle alterazioni geniche riscontrabili dal pannello ThyGenX hanno una bassa specificità per malignità. Le mutazioni RAS, mutazioni di BRAF K601E, e fusioni di PAX8-PPARG, infatti, sono state identificate sia in noduli benigni che in neoplasie maligne. Per superare questi limiti di ThyGenX è stato quindi introdotto il classificatore di espressione di miRNA, ThyraMIR.
ThyraMIR misura i livelli di espressione di 10 miRNA (Figura) mediante una PCR quantitativa real-time e utilizza un algoritmo brevetto algoritmo per classificare ciascun nodulo come ad alto rischio o a basso rischio in base al suo profilo di miRNA. ThyraMIR è eseguito come test aggiuntivo, ad eccezione dei casi in cui ThyGenX riscontri una mutazione/fusione di BRAF V600E o RET-PTC1/3. ThyraMIR è eseguito anche quando il test ThyGenX è negativo o positivo per: mutazioni di RAS, BRAF K601E e PIK3CA o per fusione PAX8-PPARG.
Tuttavia, oltre allo studio inziale, non esistono molti altri studi di post validazione su queste metodiche. Quindi, a differenza di Afirma e ThyroSeq v2, l’efficacia della metodica ThyGenX/ThyraMIR ha una scarsa evidenza scientifica.
La metodica non è attualmente disponibile in Italia.

RosettaGX Reveal
Come per ThyraMIR, RosettaGX Reveal analizza i pattern di espressione di miRNA per classificare ciascun nodulo TIR3 come ad alto rischio o a basso rischio in base al proprio profilo d’espressione di miRNA. Il pannello di Rosetta GX Reveal misura 24 miRNA, di cui 6 sequenze sono sovrapponibili a quelle del pannello di ThyraMIR.A differenza degli altri test molecolari attualmente disponibili in commercio in cui è sempre necessario ripetere l’agoaspirato tiroideo per prelevare altro maetriale, il classificatore RosettaGX Reveal è stato convalidato su materiale cellulare recuperato da strisci citologici diretti (figura). Quindi per eseguire RosettaGX Reveal è sufficiente un singolo vetrino citologico adeguatamente cellulare o una citologia su base liquida (es. ThinPrep) come substrato per il test molecolare senza dover ripetere l’agoaspirato.
RosettaGX Reveal è stato inizialmente validato in uno studio retrospettivo multicentrico ma come per ThyraMIR oltre allo studio inziale, non esistono altri studi di post-validazione. Pertanto anche l’efficacia della metodica Rosetta GX Reveal ha una scarsa evidenza scientifica.
La metodica non è attualmente disponibile in Italia.

CONCLUSIONI
Come accennato in precedenza non è facile confrontare le varie metodiche. In generale, ThyroSeq v2 e ThyGenX/ThyraMIR hanno un PPV simile (74-78%), significativamente superiore al PPV riportato per Afirma-GEC e RosettaGX Reveal (37 e 43% rispettivamente). La sensibilità di Afirma-GEC, ThyroSeq v3 e ThyGenX/ThyraMIR si mantiene costantemente vicino al 90% con un’affidabilità sovrapponibile (circa il 95%). RosettaGX Reveal, invece, sembra avere una sensibilità inferiore (74%) (figura).
Afirma GEC è la metodica con maggiore supporto scientifico. I maggior dati si riferiscono ad Afirma GEC, ma la metodica è stata sostituita da Afirma CSG e da Afirma CSG Xpression Atlas che ne hanno ulteriormente migliorate le performance diagnostiche. Afirma, pur conservando un’analisi centralizzata presso i laboratori di Veracyte a San Francisco, è l’unica metodica attualmente disponibile in Italia.
Inoltre, come è noto, ultimamente è stata rivista la classificazione dei tumori tiroidei ed è stato introdotto il concetto di NIFTP: ovvero un nodulo non invasivo, incapsulato/ben circoscritto, caratterizzato da un comportamento clinico indolente e non aggressivo in assenza di invasione capsulare o vascolare. Quindi, non è ancora chiaro se i NIFTP debbano esse considerati come noduli benigni o maligni. I dati ad oggi presenti in letteratura sulle metodiche di genetica molecolare, ovviamente, non tenevano conto di questa nuova categoria diagnostico. Pertanto, l’efficacia di queste metodiche, potrebbe essere lievemente diversa da quella riportata a seconda che negli studi i NIFTP vengano classificati come noduli benigni o come maligni.
Infine, come afferma anche l’American Thyroid Association, i test di genetica molecolare, per un corretto uso andrebbero sempre interpretati in base al contesto clinico, ecografico e dei risultati citologici. Oltre ai fattori clinici dovrebbero essere prese in considerazione le preferenze del paziente ed il rischio di malignità basata sulle caratteristiche ecografiche del nodulo. Un nodulo con microcalcificazioni, bordi irregolari e marcatamente ipoecogeno è già un nodulo ad alto rischio di malignità. E’ quindi opinione condivisa che le caratteristiche ecografiche debbano rappresentare il filtro primario per selezionare il nodulo più appropriato da testare. E prima di eseguire un qualsiasi test genetico, il paziente dovrebbe capire chiaramente in che modo il test potrà cambiarne il rischio di malignità e le eventuali indicazioni cliniche basate sul risultato del test genetico.
In sostanza il test genetico non deve essere eseguito sempre e routinariamente, ma va applicato, dopo valutazione specialistica endocrinologica, solo in casi selezionati quando è in grado di modificare significativamente l’iter diagnostico-terapeutico ed il follow-up del paziente con nodulo indeterminato.
Prenota una visita endocrinologica sull’argomento presso EndocrinologiaOggi a Roma.

Dott. Massimiliano Andrioli
Specialista in Endocrinologia e Malattie del Ricambio

Centro EndocrinologiaOggi, Roma
viale Somalia 33A, Roma
tel/fax 0686391386
cell 3337831426
Studio EndocrinologiaOggi, Lecce
via Ruffano 4, Casarano (Lecce)
tel/fax 0686391386
cell 3337831426

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