GENETICA MOLECOLARE E NODULI TIROIDEI INDETERMINATI (TIR3)

Oggi è possibile valutare in modo specifico il rischio di malignità di un nodulo tiroideo indeterminato (TIR3) utilizzando alcune metodiche di genetica molecolare. Esistono diverse metodiche, alcune ufficiali e riconosciute a livello internazionale, altre non commerciali, sperimentali, ancora in fase di studio. In questo articolo verranno descritte solo le metodiche riconosciute a livello internazionale e ne verranno descritte le basi, le finalità e le modalità di esecuzione.
Il Centro EndocrinologiaOggi di Roma, con consolidata esperienza in questo settore, si propone oramai da alcuni anni come centro di riferimento italiano per l’esecuzione delle principali e più avanzate metodiche al momento disponibili a livello mondiale nella diagnostica di questo tipo di noduli tiroidei (Afirma GSX X Atlas, Thyroseq V3, ThyGeNeXT-ThyraMIR, Rosetta GX Reveal).

INTRODUZIONE
E’ oramai riconosciuto che l’agoaspirato tiroideo sia la metodica che consente, nella maggior parte dei casi, una diagnosi certa circa la natura (benigna o maligna) del nodulo tiroideo. (Prenota un agoaspirato) Tuttavia, nel circa 20% dei casi, l’agoaspirato non permette questa distinzione. E’ il caso dei noduli con citologia indeterminata (TIR3A o TIR3B secondo la classificazione SIAPEC 2014) in cui le cellule presenti nel nodulo benigno sono indistinguibili da quelle riscontrabili in quello maligno. In questi noduli “indeterminati” solo l’asportazione del nodulo e del tessuto circostante (quindi mediante un vero e proprio intervento chirurgico) permette la diagnosi definitiva circa la natura del nodulo stesso (esame istologico).
Pertanto, per questi noduli, le linee guida attuali indicano uno stretto follow-up ecografico o mediante ripetizione dell’agoaspirato (nei TIR3A) o, nei TIR3B, l’asportazione chirurgica della lesione come unico modo per accertarsi della natura maligna o meno di un nodulo indeterminato. (Prenota un’ecografia o un agoaspirato tiroideo)
Sfortunatamente, le statistiche post-operatorie e la letteratura scientifica, evidenziano chiaramente che, a intervento eseguito, solo il 20% dei noduli indeterminati operati risulterà esser maligno e, invece, ben l’80% di questi risulterà benigno. In sostanza, attualmente, l’80% dei pazienti con questi noduli si sottopone ad un intervento chirurgico di tiroidectomia “inutilmente”, con un indubbio over-treatment, effettuato con il solo scopo di ottenere una diagnosi di certezza.

OBIETTIVO
La sfida più difficile per l’endocrinologo moderno, pertanto, è cercare di ridurre al massimo il numero di questi interventi chirurgici diagnostici.
A tal fine sono state sviluppate diverse metodiche di genetica molecolare tra cui, Afirma GSX X Atlas, Thyroseq V3, ThyGeNeXT-ThyraMIR, Rosetta GX Reveal.
Alcune di queste metodiche, le più studiate e validate a livello internazionale, sono attualmente eseguibili presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma.
Questo articolo si ripropone di illustrare le principali metodiche attualmente disponibili, spiegandone il razionale, la storia, le differenze, i dati scientifici disponibili e soprattutto le potenzialità.

CONSIDERAZIONI PRELIMINARI
Prima di entrare nel dettaglio sono necessarie alcune considerazioni.

• La certezza assoluta pre-operatoria (intendendo il 100%) di benignità o malignità di un nodulo tiroideo indeterminato TIR3 non può darla nessuno (salvo alcune eccezioni), nemmeno le più avanzate tecniche molecolari. Quindi, bisogna diffidare da chi garantisce certezze in merito. In medicina il 100% non esiste. Non esiste per i noduli TIR2 (benigni), che sono benigni al 98%, figuriamoci per i noduli TIR3 (indeterminati).
• Pertanto, se il 100% di certezza non è raggiungibile, l’obiettivo è cercare di arrivarci il più vicino possibile, attraverso la stratificazione del rischio di malignità di un nodulo utilizzando, tra i vari strumenti disponibili, anche la metodica di genetica molecolare più adatta.
• La scelta definitiva sul da farsi è sempre il frutto di un’attenta valutazione di molteplici aspetti anamnestici, clinici, strumentali, laboratoristici e genetici, che deve avvenire sempre in aperta condivisione con il paziente. La scelta finale, talvolta suggerita, è sempre concordata con il paziente, cui spetta la scelta definitiva.
• Una volta accettata l’impossibilità del 100% di benignità (o malignità), bisogna procedere nella scelta della metodica di genetica molecolare migliore da impiegare nel caso specifico.

RAZIONALE
Perché la genetica molecolare può essere utile nei noduli tiroidei indeterminati?
Per rispondere a questa domanda bisogna sapere che il cancro della tiroide è, come tutti i tumori, una malattia del genoma. Ovvero l’iniziazione e la progressione del carcinoma tiroideo avvengono a causa dell’accumulo di alterazioni genetiche ed epigenetiche quali: mutazioni somatiche, riarrangiamenti cromosomici, alterazioni nell’espressione genica, dis-regolazione del microRNA etc. Queste alterazioni genetiche del tumore tiroideo sono oramai quasi tutte conosciute.
Le prime alterazioni genetiche riscontrate nel tumore della tiroide riguardano le vie delle MAP kinasi (MAPK) e PI3K/AKT. Tra queste ricordiamo le mutazioni puntiformi di BRAF (BRAFV600E) e di RAS. (Prenota analisi BRAF) Queste, assieme al riarrangiamento di alcuni geni (RET/PTC e PAX8/PPARγ), oltre ad essere le più note, sono anche le più frequenti rappresentando circa il 70% delle mutazioni riscontrabili nel carcinoma differenziato della tiroide.
Tuttavia, la ricerca scientifica degli ultimi anni e la pubblicazione del Cancer Genome Atlas ha ridotto enormemente (dal 25% al ​​3,5%) la percentuale dei casi di carcinoma tiroideo di cui non si conoscono le alterazioni geniche.
Ne consegue, che in caso di noduli tiroidei indeterminati è possibile cercare la presenza di queste alterazioni genomiche per capire se un nodulo TIR3 è realmente benigno o maligno. Questo è il razionale dell’impiego della diagnostica molecolare.

METODICHE COMMERCIALI DISPONIBILI
Innanzitutto, bisogna comprendere la differenza tra i test commerciali e i test non commerciali.
I test non commerciali sono dei test di genetica molecolare solitamente eseguiti presso centri universitari o presso grossi laboratori di genetica, spesso all’interno di protocolli di ricerca finalizzati alla pubblicazione di studi scientifici. Queste metodiche variano da centro a centro, poiché ogni centro costruisce la propria metodica molecolare in base alle proprie possibilità e alle tecnologie di cui dispone. Ne consegue che queste metodiche non commerciali sono spesso molto eterogenee e quindi tra loro mal confrontabili. Spesso, inoltre, i test non commerciali prendono spunto proprio dai test commerciali, più studiati, già scientificamente provati e collaudati, e propongono la ricerca di alterazioni geniche simili ma con una metodica la cui efficacia finale, però, è tutta da validare con degli studi scientifici. Si tratta, quindi, di metodiche potenzialmente utili, ma con una validità ancora tutta da dimostrare.
Inoltre, l’accesso ai test molecolari non commerciali, proprio per la loro non ufficialità scientifica e medico legale, è spesso difficoltoso per il paziente, poiché variabile, talora discrezionale e spesso non standardizzato.
Quindi, le metodiche non commerciali, con le varie differenze, sono metodiche prospetticamente e indubbiamente utili, ma la cui validità scientifica e clinica è ancora tutta da dimostrare. Infatti, proprio perché costruite con finalità di ricerca e di pubblicazione scientifica, non possiedono ancora quella forza scientifica propria delle metodiche commerciali che, invece, possono contare su studi pilota già pubblicati e su studi clinici, più o meno numerosi, che ne confermano l’applicabilità nella pratica clinica quotidiana.
Ogni test commerciale, infatti, ha già queste caratteristiche:

• Deve identificare e definire con precisione il pannello mutazionale o il classificatore utilizzato in un determinato set clinico (unico aspetto in comune con i test non commerciali).
• Deve aver convalidato il pannello/classificatore con uno studio pilota (aspetto che i test non commerciali non sempre hanno) (figura).
• Deve essere confermato da studi clinici successivi, preferibilmente prospettici, in cieco, multicentrici e indipendenti. Quest’ultima caratteristica è quasi esclusiva di test molecolari commercializzati già da tempo (come Afirma e Thyroseq) (figura).

Fatta questa premessa ne consegue che i test molecolari commerciali, anche in virtù della presunta maggior forza scientifica, hanno anche una valenza medico legale che i test sperimentali non commerciali, per forza di cose, non possono ancora avere.
I test commerciali di genetica molecolare al momento disponibili a livello mondiale sono:

• Afirma GSX X Atlas (2012, Veracyte, San Francisco, California)
• Thyroseq V3 (2014, CBLPath, New York e Università di Pittsburgh, Pennsylvania)
• ThyGeNeXT-ThyraMIR (2015, Interpace Diagnostics, Parsippany, New Jersey)
• Rosetta GX Reveal (2017, Rosetta Genomics, Inc, Philadelphia, Pennsylvania)

Si tratta di metodiche tutte con brevetto statunitense. (Prenota un test molecolare tiroideo) Per completezza descrittiva, si citano anche altri due test commerciali non statunitensi: Plus ThyroPrint (GeneproDX, Santiago, Chile) e Mir-THYpe (ONKOS Diagnosticos LDTA molecolare, Ribeirao Preto, Brasile) che, tuttavia, al momento della pubblicazione di quest’articolo, non sono stati ancora certificati dall’American College of Pathologists e su cui non vi è sufficiente letteratura scientifica.
Inoltre, si ricorda che Rosetta Genomics, la società che ha sviluppato Rosetta GX Reveal, è stata recentemente acquisita da Interpace Diagnostics, società che commercializza ThyGeNeXT-ThyraMIR.
Afirma non è più attualmente disponibile in Europa. Infine, si ricorda, che al momento, il test commerciale attuamente disponibile in Italia ad uso clinico è Thyroseq V3, eseguibile presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma, centro di riferimento in Italia per la genetica molecolare tiroidea.

TIPOLOGIA DI TEST DISPONIBILI
A questo punto, entriamo nel dettaglio, chiarendo le principali differenze tra i test di genetica molecolare. I test molecolari, infatti, possono essere distinti in:

• test di esclusione (rule out)
• test di inclusione (rule in)

Un test di esclusione è un test che, nell’ambito di un nodulo tiroideo indeterminato TIR3, è in grado di affermare che un nodulo è sicuramente benigno, di escluderne la malignità e, quindi, di escludere l’intervento chirurgico (per questo il termine test di esclusione). Un test di esclusione, per identificare i noduli sicuramente benigni richiede un valore predittivo negativo (NPV) molto elevato (almeno il 94% come nel caso dell’agoaspirato standard per i noduli TIR2). (figura)
Un test di inclusione, invece, è un test che, nell’ambito di un nodulo tiroideo indeterminato TIR3, è in grado di identificare un nodulo sicuramente maligno, di indicarne la malignità, e quindi di suggerire fortemente l’intervento chirurgico (da cui test di inclusione). Un test di inclusione, per identificare i noduli sicuramente maligni richiede un valore predittivo positivo (PPV) molto elevato (almeno il 98% come nel caso dell’agoaspirato standard per i noduli TIR5). (figura)
Tra i test commerciali al momento disponibili, Afirma e Rosetta sono ottimi test di esclusione, ThyGeNeXT è un test di inclusione, mentre Thyroseq V3 e ThyGeNeXT-ThyraMIR funzionano sia come test di esclusione che di inclusione. (figura) Ovviamente per i test non commerciali, in assenza di sufficienti validazioni scientifiche, non è possibile affermare se un test è di esclusione o di inclusione.
In ogni modo, con il passare del tempo, con l’implementazione di queste metodiche commerciali e con la parziale fusione tra alcune di queste, tutti questi test in commercio presentano delle performance diagnostiche sempre migliori e dei valori predittivi sempre più alti e sempre più simili tra loro. In sostanza si può affermare che, fatta eccezione per qualche decimale, queste metodiche oramai si assomigliano sempre di più anche in termini di accuratezza e affidabilità.

VALORE PREDITTIVO
Per comprendere bene il risultato di un qualsiasi test, tuttavia, bisogna chiarire prima il significato di alcuni termini statistici, in particolare il Valore Predittivo. Questo può essere: valore predittivo negativo (VPN) o valore predittivo positivo (PPV).
Il valore predittivo negativo (VPN) di un test molecolare indica, dopo che questo test ha categorizzato come benigno un nodulo tiroideo indeterminato, qual è la possibilità (post-test) che questo nodulo sia realmente benigno.
Al contrario, il valore predittivo positivo (PPN) di un test molecolare indica, dopo che questo test ha classificato come maligno un nodulo tiroideo indeterminato, qual è la possibilità (post-test) che questo nodulo sia realmente maligno.
Chiariamo l’importanza di questo dato con un esempio. In un determinato contesto, un test molecolare (Afirma, ad esempio) ha un predittivo negativo (VPN) molto elevato (97%). Ciò significa che se un nodulo tiroideo indeterminato è classificato come benigno da Afirma, allora questo nodulo ha un’elevatissima probabilità di essere realmente benigno (non del 100% ma del 97%, sostanzialmente uguale a quella del nodulo TIR2 che, ricordiamo, indica una formazione benigna (non al 100% ma al 98%). Ovviamente per i test non commerciali, in assenza di sufficienti validazioni scientifiche, non è possibile fornire informazioni certe sul loro valore predittivo.
Inoltre, si ricorda che, a differenza della sensibilità e della specificità che sono delle caratteristiche intrinseche di un test, il valore predittivo può variare a seconda della prevalenza del tumore tiroideo nella specifica popolazione studiata.
Pertanto, per una corretta interpretazione del test molecolare e per fornire delle corrette indicazioni chirurgiche, sarebbe auspicabile conoscere il rischio pre-test di neoplasia per ogni categoria citologica. Tuttavia, routinariamente e, in una società globalizzata come quella attuale, è quasi impossibile conoscere il rischio di neoplasia pre-test per ogni singolo paziente che può provenire da diversi laboratori.
Ne consegue che, prima che un test molecolare sia suggerito a un paziente, sarebbe opportuno almeno valutare il rischio pre-test di malignità del nodulo del paziente da sottoporre alle tecniche molecolari.
In particolare, la stratificazione del rischio di neoplasia, dovrebbe essere eseguita mediante la valutazione di:

• familiarità per cancro alla tiroide.
• anamnesi positiva per esposizione a radiazioni.
• valutazione delle caratteristiche citologiche (ad esempio atipia nucleare, che aumenta il rischio di malignità).
• caratteristiche ecografiche (marcata ipoecogenicità, microcalcificazioni, margini irregolari etc.).

Con una corretta valutazione (e interpretazione) di queste informazioni sarà quindi possibile individuare il giusto paziente con nodulo tiroideo indeterminato a cui suggerire il più corretto (e per lui specifico) test genomico molecolare. Quest’analisi pre-test, oltre a fornire una linea di riferimento per una corretta indicazione ai test, consente anche di sfruttare al meglio le potenzialità di ciascun metodo molecolare, garantendo una maggior affidabilità nell’interpretazione dei risultati. (Prenota una visita con uno specialista sull’argomento)

STORIA
In questo paragrafo s’intende descrivere la storia e, conseguentemente alcune differenze costitutive, che hanno portato alla nascita degli attuali test molecolari commerciali. Le moderne metodiche molecolari possono valutare: a) il DNA; b) l’espressione genica.
DNA
Come accennato prima, le alterazioni genetiche del tumore differenziato della tiroide sono oramai quasi tutte conosciute (solo nel 3.5% dei tumori tiroidei rimangono sconosciute). BRAFv600E, RAS e i riarrangiamenti (RET/PTC e PAX8/PPARγ) rappresentano circa il 70% delle mutazioni riscontrabili. Tuttavia, ciascuna alterazione, presa singolarmente, ha una sensibilità e specificità troppo basse per essere clinicamente rilevanti nel nodulo indeterminato. Ad esempio, la prevalenza delle mutazioni BRAF nelle lesioni indeterminate neoplastiche è molto bassa (4,6%).
Per questo Nikiforov, suggerì che, mettendole assieme e analizzando un pannello di più mutazioni (BRAF, RAS, RET/PTC, PAX8/PPARg) era possibile ottenere un aumento di sensibilità (44% -> 80%) e dell’accuratezza (dal 93,3% -> 97,4%) dell’analisi genomica. Sulla base di questa pubblicazione scientifica, è stato creato il primo test molecolare commerciale su DNA, denominato “miRInform” (2009), successivamente rinominato e sostituito dall’attuale ThyGeNext. Questo pannello valutava, con PCR, sette alterazioni geniche (BRAF, KRAS, HRAS, NRAS, RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPARg). L’avvento di tecnologie di sequenziamento di ultima generazione (Next Generation Sequencing, NGS) in grado di sequenziare e scoprire simultaneamente alterazioni genetiche in specifiche aree (ad esempio nel tumore tiroideo), ha permesso poi lo sviluppo di Thyroseq. Con Thyroseq, lo studio del DNA è effettuato mediante NGS (anziché PCR), e oltre alle sette alterazioni ricercate da “miRInform”, sono identificati anche nuovi driver mutazionali di più recente acquisizione (PIK3CA, TP53, TSHR, PTEN, RET, AKT1, CTNNB1, TERT) e altre fusioni geniche (BRAF, RET, NTRK1, NTRK3, AKT1, PPARG, THADA).
Espressione genica
E’ possibile studiare le alterazioni genomiche dei noduli tiroidei TIR3 anche in un modo completamente alternativo ai test mutazionali del DNA.
Infatti, è possibile valutarne anche l’espressione genica: ovvero studiare come i vari geni del DNA siano differenzialmente espressi. Questo tipo di analisi, utilizza la bioinformatica, modelli artificiali e algoritmi informatici, in grado di creare dei Classificatori Molecolari capaci di descrivere il rischio di malignità (o benignità) di un nodulo tiroideo. Queste tecnologie, basate sul micro-array, valutano l’espressione dell’RNA messaggero (mRNA) di un numero molto elevato di geni.
Afirma, nella sua prima versione GEC (Gene Expression Classifier), è la prima metodica che applica quest’approccio utilizzando la tecnologia microarray su mRNA.
La stessa tipologia di analisi, tuttavia, può essere applicata anche sul micro-RNA (miR). I microRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l’espressione genica influenzando la stabilità e la traduzione dell’mRNA stesso. In questo modo sono nate le due ultime metodiche molecolari messe in commercio: ThyraMIR e Rosetta GX Reveal. Queste ultime due metodiche, pertanto, esattamente come Afirma valutano i profili di espressione genica, ma studiando il micro-RNA (e non l’mRNA). Quanto descritto in questo paragrafo può essere schematizzato nella seguente figura. Nei paragrafi successivi, invece, sono singolarmente e brevemente descritte le principali metodiche molecolari ora disponibili.

THYROSEQ V3
ThyroSeq è un test multigenico basato su una metodica di nuova generazione per lo studio del DNA (Next Generation Sequencing, NGS). E’ in grado di valutare il DNA di 56 geni (mutazioni puntiformi, piccole inserzioni/delezioni in 14 geni e 42 tipi di fusioni geniche) a anche i livelli di espressione di 16 geni. (figura)
La validazione clinica di ThyroSeq è stata dimostrata in alcuni studi, non sempre multicentrici, sui noduli tiroidei con citologia indeterminata.
Mentre il riscontro di alcune mutazioni (BRAF V600E, TERT), è molto specifico (100%) per il carcinoma papillare della tiroide, il riscontro di mutazioni di RAS o delle fusioni PAX8/PPARg non sempre fornisce sicurezza sulla natura della lesione. E’ noto, infatti, che mutazioni di RAS possono riscontrarsi nei noduli benigni, mentre alcune lesioni maligne possono non presentare mutazioni di RAS. L’identificazione di questa mutazione, quindi, può essere fonte di confusione. ThyroSeq, inoltre, sembra funzionare meglio nei noduli Bethesda IV (TIR3B) che nei Bethesda III (TIR3A).
Nonostante ciò, Thyroseq V3, l’ultima e più avanzata versione di Tyroseq, è indubbiamente una metodica molto potente, che sembra funzionare sia come test di esclusione sia come test d’inclusione. Il materiale da analizzare solitamente deve essere prelevato dal nodulo mediante un agoaspirato e deve essere inserito in alcune provette specifiche. In alternativa è possibile anche prelevare il materiale direttamente dai vetrini di un precedente agoaspirato, ammesso che questi abbiano materiale sufficiente e delle caratteristiche specifiche che devono essere valutate caso per caso.
Thyroseq V3 può essere eseguito presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma. (Prenota Thyroseq)

ThyGeNEXT-ThyraMIR
ThyGenX è un test di sequenziamento di ultima generazione (NGS) mirato la ricerca di mutazioni in 5 geni (BRAF, KRAS, HRAS, NRAS, PIK3CA) e di 3 tipi di fusione (RET/PTC1, RET/PTC3, PAX8/PPARG) che solitamente si associano a neoplasia tiroidea.
Per migliorarne l’efficienza, è stato associato ThyraMIR, il classificatore di espressione di miRNA.
ThyraMIR misura i livelli di espressione di 10 miRNA mediante PCR e utilizza un algoritmo proprietario per classificare ciascun nodulo come avente un profilo miRNA ad alto rischio o basso rischio (figura).
Il materiale da analizzare solitamente deve essere prelevato dal nodulo mediante un agoaspirato e deve essere inserito in alcune provette speciali. In alternativa è possibile anche prelevare il materiale direttamente dai vetrini di un precedente agoaspirato, ammesso che questi abbiano materiale sufficiente e delle caratteristiche specifiche che devono essere valutate caso per caso.
La metodica ThyGeNEXT-ThyraMIR non è attualmente disponibile in Italia.

ROSETTA GX REVEAL
Il pannello mutazionale di Rosetta GX Reveal, invece, misura un numero superiore di miRNA (esattamente 24 miRNA), si cui 6 esattamente uguali a quelle ricercate nel pannello di 10 miRNA di ThyraMIR. (figura)
Sulla base dell’analisi dei pattern d’espressione dei miRNA, Rosetta GX Reveal è in grado di classificare le lesioni indeterminate come “benigne” o “sospette per il profilo miRNA”.
Il classificatore miRNA di Rosetta GX Reveal è stato validato analiticamente su materiale cellulare recuperato da strisci citologici diretti. Pertanto l’analisi molecolare viene effettuata su materiale direttamente ricavato da precedenti vetrini.
Infatti, rispetto all’mRNA, i miRNA sono relativamente stabili e possono essere isolati dai classici vetrini fissati con formalina o da campioni citologici fissati con alcol.
Rosetta GX Reveal è stato clinicamente validato in uno studio multicentrico retrospettivo di 189 campioni citologicamente indeterminati con follow up istologico.
Come detto prima, Rosetta Genomics, la società che ha lanciato Rosetta GX Reveal è stata recentemente acquisita da Interpace Diagnostics, società che commercializza ThyGeNeXT-ThyraMIR.
Pertanto, al momento della scrittura di quest’articolo, Rosetta non è più disponibile ad uso clinico, né in Italia né in altri centri.

AFIRMA
Afirma è un test molecolare, pubblicato sul NEJM nel 2012, che da allora vanta una storia consolidata da anni di commercializzazione e da numerosi studi clinici successivi.
Tra i test di genetica molecolare attualmente disponibili è indubbiamente il più noto, confermato da studi clinici di post-validazione. Dalla sua prima versione, nel tempo, ha subito miglioramenti e implementazioni che ne hanno migliorate le performance diagnostiche. Afirma GEC (Gene Expression Classifier) è stata sostituita da Afirma GSC (Genomic Sequencing Classifier), a sua volta attualmente proposta come Afirma GSC X Atlas.

GEC
La prima versione, Afirma GEC, è un test basato su microarray che utilizza un algoritmo proprietario per stratificare un nodulo citologicamente indeterminato come aventi profilo di espressione dell’mRNA, benigno o sospetto.
Afirma GEC è un ottimo test di esclusione. In virtù della sua elevata sensibilità e dell’elevato valore predittivo negativo, Afirma è in grado di individuare i noduli sicuramente benigni e quindi di aiutare a evitare (test di esclusione) l’intervento chirurgico.
La metodica prevede l’analisi di alcune cassette di espressione genica specifiche per profili di mRNA solitamente associati a: carcinoma midollare tiroideo, tessuto paratiroideo o altri tumori metastatici. Nel caso in cui non vengano riscontrate queste alterazioni, il campione passerà al classificatore principale che valuta il profilo di espressione di ben 142 geni. Se anche in questo classificatore non si riscontrano di profili di espressioni alterati, il campione sarà classificato come Benigno, in caso contrario come Sospetto. (figura)
Lo studio pubblicato sul NEJM, come confermato da studi successivi, dimostrava che, in virtù dell’elevato valore predittivo negativo (96%), sostanzialmente sovrapponibile a quello dei noduli TIR2 (98%), un nodulo citologicamente indeterminato che viene riclassificato come Benigno da Afima, può essere gestito esattamente come un nodulo TIR2, ovvero con osservazione clinica, senza dover ricorrere all’intervento chirurgico.
Con Afirma GEC circa la metà dei pazienti (esattamente 47%) viene classificato come benigno e può evitare l’intervento. (figura)
Come detto, sebbene lo studio di Alexander del 2012 rimanga il punto di riferimento per valutare le prestazioni del test, il crescente numero di pubblicazioni internazionali conferma la sua applicabilità clinica nella vita reale. (figura)
Un iniziale limite della prima versione di Afirma (Afirma GEC) era rappresentato dall’alta percentuale di lesioni ossifile (cellule Hurthle) che erano erroneamente classificate come Sospette da GEC. Tale limite, è stato superato dalla seconda versione, Afirma Genomic Sequencing Classifier GSC.

GSC
Afirma GSC, combina il sequenziamento classico dell’mRNA con microarray di GEC, con un sequenziamento di RNA che consente di estrarre ancora più informazioni genomiche dal campione di aspirato tiroideo, identificando alterazioni genomiche precedentemente non rilevabili da nessun altra tecnica. Afirma GSC, quindi, è un test che combina il sequenziamento di nuova generazione di RNA con metodi analitici in grado di rilevare anche piccole alterazioni genomiche altrimenti non rilevabili con metodi tradizionali (come il sequenziamento basato sul DNA).
In questo modo Afirma GSC analizza i profili di espressione di RNA di oltre 1.000 geni. In più, oltre all’espressione genica, valuta anche la presenza di varianti del DNA, fusioni, varianti del numero di copie e altre informazioni potenzialmente predittive sul cancro della tiroide.
Afirma GSC, rispetto a GEC, riclassifica come benigno un numero ancora maggiore (del 30%) (figura) di noduli indeterminati (GEC 44 % vs GSC 66%). (figura)
Questo miglioramento della performance diagnostica avviene a tutti i livelli, ma soprattutto a carico delle lesioni ossifile che subiscono un miglioramento in termini di specificità dall’11.8% al 58.8%, con un conseguente aumento delle formazioni che vengono correttamente riclassificate come benigne. (figura) (Prenota Afirma GSC)

GSC X ATLAS
L’ultima versione, GSC X ATLAS, altro non è che GSC su cui, in caso di nodulo classificato come Sospetto, sono descritte le eventuali alterazioni riscontrate (761 varianti, 130 fusioni, 511 geni unici etc.) e soprattutto il rispettivo rischio di malignità in funzioni dei dati riportati in letteratura. (figura)
Per questo qualcuno ha suggerito anche l’applicabilità di Afirma GSC X ATLAS anche nei noduli TIR4.
In conclusione, si può affermare che Afirma è indubbiamente una delle metodiche più avanzate in questo momento disponibili a livello mondiale per la diagnostica pre-operatoria dei noduli tiroidei indeterminati (TIR3). Con essa si è in grado di stratificare biologicamente il rischio di neoplasia di un nodulo tiroideo indeterminato e di selezionare i pazienti che sono a bassissimo rischio (<4%) di avere un tumore. Si tratta, pertanto, di un validissimo test di esclusione (“rule-out”). Se un nodulo è benigno con Afirma, allora si può praticamente escludere la malignità e, quindi, evitare l’intervento chirurgico.
Sviluppata negli Stati Uniti, commercializzata da Veracyte, San Francisco (USA), si è poi diffusa in altre nazioni (Canada, Israele, Emirati Arabi Uniti).
EndocrinologiaOggi è il primo centro in Italia in cui è possibile eseguire Afirma ad uso clinico nei noduli tiroidei indeterminati. Il materiale da analizzare solitamente si preleva dal nodulo mediante un semplice agoaspirato, deve essere inserito in una provetta speciale, e sarà analizzato in laboratorio centralizzato, a livello mondiale, sito a San Francisco.
La metodica GSC X ATLAS può essere eseguita presso il Centro EndocrinologiaOggi di Roma. (Prenota Afirma GSC X Atlas)

Prenota una visita specialistica endocrinologica sull’argomento.

Dott. Massimiliano Andrioli
Specialista in Endocrinologia e Malattie del Ricambio

Centro EndocrinologiaOggi, Roma
viale Somalia 33A, Roma
tel/fax 0686391386
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Studio EndocrinologiaOggi, Lecce
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tel/fax 0686391386
cell 3337831426

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